ViralStars^TM  Lentivirus Packaging Cell Line

Catalog Number：CL110001

01/產品概述

慢病毒是一種逆轉錄病毒，能使外源基因整合入宿主細胞的基因組，實現外源基因穩(wěn)定、長期的表達，比一般的逆轉錄病毒具有更高的滴度和更廣的宿主范圍。攜帶外源基因的慢病毒載體與包裝載體（產生病毒顆粒所需的輔助蛋白）一同轉染包裝細胞，即可進行病毒的包裝。包裝好的慢病毒為假型病毒（病毒感染目的細胞后不會再感染其他細胞，也不會利用宿主細胞產生新的病毒顆粒，慢病毒中的毒性基因已被剔除并被外源性目的基因所取代），分泌到細胞外的培養(yǎng)基中，經過離心取得上清液后進行慢病毒濃縮，濃縮后的慢病毒液可以直接用于宿主細胞的感染，目的基因進入到宿主細胞后，經過反轉錄，整合到基因組，從而實現外源基因在宿主細胞中的表達（下圖）。

要充分利用慢病毒包裝系統(tǒng)產生高滴度的慢病毒顆粒，就需要宿主細胞系具備易于轉染并且可以高水平表達病毒蛋白質的特性。我們的ViralStars Lentivirus Packaging Cell Line經過了克隆篩選，可以充分滿足這些需求。當與我們優(yōu)質的ViralStars LP Lentivirus Packaging Kit（LP110）高滴度慢病毒包裝試劑盒配合使用時，可以獲得更高的慢病毒滴度（高達10⁸ TU/mL）。ViralStars Lentivirus Packaging Cell Line是人胚胎腎細胞轉化細胞HEK 293的亞克隆，經過基因編輯改進后篩選出的單克隆細胞株，具備高細胞活性、低細胞凋亡水平、可高度轉染并高水平表達病毒蛋白質等特性。

02/產品組分

03/保存條件

為確保細胞活力，細胞產品接收后應立即進行細胞培養(yǎng)及后續(xù)操作（詳見05/實驗步驟）。

04/產品特點

2 高細胞活性、低細胞凋亡水平

2 高度易于轉染

2 高水平表達重組慢病毒

05/實驗步驟

一、ViralStars Lentivirus Packaging Cell Line細胞傳代

1. 待細胞密度達90% 左右，即可進行傳代培養(yǎng)。棄去舊培養(yǎng)基，用PBS潤洗細胞1-2次。

2. 加入適量胰酶消化液，置于37℃培養(yǎng)箱中消化細胞約1-2分鐘，顯微鏡下觀察細胞消化情況，若觀察到大部分細胞變圓并脫落，則迅速拿回操作臺，加入與胰酶等量的*培養(yǎng)基（DMEM，10% FBS，1% 雙抗）終止消化。

3. 輕輕吹打細胞，使細胞*脫落后吸出，1000 rpm離心5分鐘，棄去上清液，用新鮮的*培養(yǎng)基重懸細胞。

4. 將細胞懸液按合適的比例（推薦1:4-1:5）接種到新的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中，置于37℃ 5% CO₂培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

二、ViralStars Lentivirus Packaging Cell Line細胞凍存

1. 選擇處于指數生長期的細胞，按照常規(guī)方法收集細胞于離心管中。

2. 1000 rpm，離心5分鐘，收集培養(yǎng)細胞沉淀，棄上清液。

3. 加入適量4℃預冷的LeapWal Cell Freezing Medium (1x)(PZ110R) 重懸細胞，制成細胞懸液。

? 按照細胞密度和所用細胞凍存管的尺寸計算所需凍存液的量，推薦凍存密度：1x10⁶ 至5x10⁶ cells/mL。

4. 將細胞懸液分裝至已標記的凍存管中，建議每管1mL或1.5mL。

5. 直接將細胞凍存管放入-80℃超低溫冰箱中，可長期冷凍保存。如果想放入液氮中長期保存，需先放入-80℃冰箱至少12小時，方可移至液氮罐中長期保存。

三、ViralStars Lentivirus Packaging Cell Line細胞復蘇

1. 在15 mL離心管中加入5-10 mL平衡至室溫的*培養(yǎng)基。

2. 從-80℃冰箱/液氮中取出凍存的細胞，立即放入37℃水浴鍋或其他細胞復蘇設備中，迅速解凍。

3. 將凍存管中的細胞懸液逐滴轉移至預先準備好的含*培養(yǎng)基的離心管中，1000 rpm，離心5分鐘，收集細胞沉淀，棄上清（操作時小心，切勿將細胞沉淀移去）。

4. 加入適量平衡至室溫的*培養(yǎng)基重懸細胞，接種到事先準備好的培養(yǎng)容器中，輕輕搖晃培養(yǎng)容器，使細胞分布均勻。

5. 培養(yǎng)5-16 h后，觀察細胞狀態(tài)，可視情況更換預熱的新鮮*培養(yǎng)液，之后進行常規(guī)細胞培養(yǎng)及傳代。

06/適用范圍

ViralStars Lentivirus Packaging Cell Line經過了基因編輯及單克隆篩選，具備高細胞活性、低細胞凋亡水平、可高度轉染并高水平表達病毒蛋白等特性，兼容所有慢病毒包裝體系。

07/注意事項

1. 該產品與我們優(yōu)質的ViralStars LP Lentivirus Packaging Kit（LP110）高滴度慢病毒包裝試劑盒配合使用時，可以獲得更高的慢病毒滴度（高達10⁸ TU/mL）。

2. 為了您的健康安全，請規(guī)范操作，穿戴實驗服與手套開展實驗。

3. 所有慢病毒操作均需在BSL2級生物安全柜中進行。

4. 本產品僅供科研使用，請勿用于臨床診斷及治療。

08/實驗案例分析

1. 提前一天使用10 cm細胞培養(yǎng)皿培養(yǎng)ViralStars Lentivirus Packaging Cell Line（CL110001）及其它兩種常用HEK 293包裝細胞系（HEK293T、293FT），待細胞密度為75% 左右開始包裝慢病毒。

2. 使用ViralStars LP Lentivirus Packaging Kit（LP110-10）進行慢病毒包裝。取3個2 mL EP管，分別加入10 μL慢病毒包裝輔助質?；旌衔铮≒ackage Plasmid Mix），2.5 μL表達GFP的對照質粒（Control Plasmid），輕輕混合，加入32 μL PolyShooter轉染試劑與質?；旌?，室溫孵育3分鐘。

3. 往上述混合物中加入1.8 mL無血清無雙抗的DMEM基礎培養(yǎng)基，輕輕混勻，在室溫下靜置30分鐘，形成轉染試劑-核酸復合物。

4. 將上述1.8 mL轉染試劑-核酸復合物輕輕地逐滴均勻加入10 cm皿慢病毒包裝細胞中，輕輕搖動培養(yǎng)皿混勻，做好標記，置于37℃，5% CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)產毒。

5. 轉染24 h后，棄去初始病毒上清液，加入10 mL新鮮的*培養(yǎng)基(DMEM +10% FBS)至10 cm細胞培養(yǎng)皿中，置于37℃，5% CO₂培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

6. 轉染48 h后，收集病毒上清液，再加入10 mL新鮮的*培養(yǎng)基(DMEM +10% FBS)至10 cm細胞培養(yǎng)皿中，置于37℃，5% CO₂培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

7. 轉染72 h后，進行二次病毒上清液收集，與48 h收集的上清液混合后，300xg離心10分鐘以除去細胞碎片，0.22 μm濾器過濾，使用ViralStars LC Lentivirus Concentration Solution慢病毒濃縮試劑盒（LC110R）進行20倍濃縮，使用1 mL ViralStars LS Lentivirus Storage Solution（LS110R）分別重懸三組慢病毒顆粒。

8. 孔稀釋法測定病毒滴度。

(1) Day1：準備細胞

對生長狀態(tài)良好的293T細胞消化計數后稀釋至?1-3x10⁵個?/mL?，加入96孔板，100?μL/孔（1-3x10⁴個?/孔），每?種慢病毒設6個梯度孔，置于37℃，5% CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

(2) Day2：病毒的稀釋與感染

在EP管中做10倍梯度稀釋，連續(xù)6個稀釋梯度。稀釋方法如下：準備6個?菌EP管，每個EP管中加?90μL 新鮮的*培養(yǎng)基（含10 μg/mL polybrene），取待測定病毒液10 μL加?到第?個EP管中（標記10 μL），混勻后取10 μL病毒稀釋液加?到第?個EP管中（標記1 μL），以此類推，直到稀釋到最后?管。棄去96孔板中原有的培養(yǎng)基，將稀釋好的病毒依次加入孔中，并做好標記，??操作，不要吹起細胞，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h。

(3) Day3：棄病毒，換液

吸去含病毒的培養(yǎng)基，在每個孔中再加入?100 μL?預熱的新鮮*培養(yǎng)基。

(4) Day4：熒光計數與滴度計算

感染36-48 h后，采用流式細胞術對熒光比例合適（10%-50%）的連續(xù)兩個梯度進行陽性細胞統(tǒng)計，計算出病毒滴度，實驗結果如圖2所示。

圖2: ViralStars Lentivirus Packaging Cell Line慢病毒包裝細胞系可制備出更高滴度的慢病毒顆粒。

我們使用ViralStars LP Lentivirus Packaging Kit（LP110-10）進行慢病毒包裝，比較ViralStars Lentivirus Packaging Cell Line和其它兩種常用HEK 293包裝細胞系的病毒制備能力，ViralStars Lentivirus Packaging Cell Line明顯優(yōu)于其他細胞系——所獲得的病毒滴度比293FT細胞高出10倍，比親代HEK 293細胞系高出26倍。

09/其他相關產品